ФРАГМЕНТЫ ИЗ КНИГИ Андре Моруа «Флеминг» об открытии пенициллинаАндре Моруа - Жизнь Александра Флеминга » Страница 35 » Книги читать онлайн бесплатно без регистрации (kniga-online.org)IX. Плесневый бульон
Большинство крупных научных открытий сделано в результате продуманных опытов, но отчасти и благодаря везению. Пастеру, человеку на редкость волевому, который добивался истины при помощи логических рассуждений и опытов, иногда помогала и судьба. Он взялся за решение случайных частных проблем, и они привели его к обобщениям.
…
Флеминг издавна искал такое вещество, которое уничтожало бы патогенные микробы, не вредя клеткам больного. Это магическое вещество случайно залетело на его рабочий стол. Но он бы не обратил внимания на незнакомого посетителя, если бы не ждал его пятнадцать лет.
Снова, как в начале своей научной деятельности, он составил опись имевшихся в распоряжении медиков средств борьбы против инфекций. Они были недостаточными, но он не отчаивался. «Теперь, – писал он, – видимо, едва ли удастся найти антисептик, который убивал бы все бактерии в кровеносном русле, но остается некоторая надежда создать такие химические вещества, которые будут избирательно действовать на определенные бактерии и убивать их в крови, оставляя интактными другие патогенные микробы...»
Он изучал новый антисептик – меркурохром, убивавший стрептококки, но опять же при концентрации, которую не мог вынести человеческий организм. Не попробовать ли вводить в кровь этот препарат в более слабых дозах, размышлял Флеминг, может быть, тогда удастся найти концентрацию, при которой не будут уничтожаться ни клетки человеческого организма, ни стрептококки, но эти последние станут менее стойкими и более чувствительными к действию фагоцитов.
В маленькой лаборатории Флеминга было все так же тесно и темно... Повсюду стояли культуры, но Флеминг, несмотря на внешний беспорядок, моментально находил ту, которая была ему нужна.
…
Флемингу пришлось поэтому повторить работу Прайса и заняться исследованием многочисленных колоний стафилококков. Для наблюдения под микроскопом этих колоний, которые культивировались на агаре в чашках Петри, приходилось снимать крышки и довольно долго держать их открытыми, что было связано с опасностью загрязнения.
Прайс навестил Флеминга в его лаборатории. Он застал его, как всегда окруженного многочисленными чашками. Осторожный шотландец не любил расставаться со своими культурами, пока не убедится, что они не дадут ему ничего нового. Его часто высмеивали за беспорядок в лаборатории. Но Флеминг доказал, что беспорядок может быть плодотворным. Он в ворчливо-шутливом тоне упрекнул Прайса за то, что вынужден из-за него вновь проделывать трудоемкую работу, и, разговаривая, снял крышки с нескольких старых культур. Многие из них оказались испорчены плесенью. Вполне обычное явление. «Как только вы открываете чашку с культурой, вас ждут неприятности, – говорил Флеминг. – Обязательно что-нибудь попадет из воздуха». Вдруг он замолк и, рассматривая что-то, сказал безразличным тоном: «Thatisfunny... Это очень странно». На этом агаре, как и на многих других, выросла плесень, но здесь колонии стафилококков вокруг плесени растворились и вместо желтой мутной массы виднелись капли, напоминавшие росу.
Прайс не раз наблюдал старые колонии микробов, растворившиеся по той или иной причине. Он решил, что плесень, несомненно, выделяла какие-то смертоносные для стафилококков кислоты. Опять-таки обычное явление. Но, видя, с каким живым интересом Флеминг отнесся к этому явлению, Прайс сказал: «Точно так же вы открыли лизоцим». Флеминг ничего не ответил. Он снял платиновой петлей немного плесени и положил ее в пробирку с бульоном. Из разросшейся в бульоне культуры он взял кусочек площадью примерно в квадратный миллиметр. Он явно хотел сделать все, чтобы сохранить штамм этой таинственной плесени.
…
Что такое плесень? Это крошечный грибок, он бывает зеленым, коричневым, желтым или черным и вырастает в сырых чуланах или на старой обуви. Эти растительные организмы еще меньше красных кровяных шариков и размножаются при помощи
спор, которые находятся в воздухе. Когда одна из этих спор попадает в благоприятную среду, она прорастает, образует набухания, затем посылает во все стороны свои разветвления и превращается в сплошную войлочную массу.
Флеминг пересадил несколько спор в чашку с агаром и оставил их прорастать на четыре или пять дней при комнатной температуре. Вскоре появилась плесень, подобная первоначальной. Флеминг засеял тот же агар разными бактериями, расположив их отдельными полосками, лучами, расходящимися от плесени. Подержав культуру какое-то время в термостате, он обнаружил, что некоторые микробы выдержали соседство грибка, в то время как рост других начинался на значительном расстоянии от плесени. Плесень оказалась губительной для стрептококков, стафилококков, дифтерийных палочек и бациллы сибирской язвы; на тифозную палочку она не действовала.
Открытие становилось необычайно интересным. В отличие от лизоцима, который был эффективен в основном против безвредных микробов, плесень, видимо, выделяла вещество, которое останавливало рост возбудителей некоторых самых опасных заболеваний. Значит, она могла стать могучим терапевтическим оружием. «Мы обнаружили плесень, которая, может быть, принесет какую-нибудь пользу», – говорил Флеминг. Он вырастил свой «пенициллиум» в большом сосуде с питательным бульоном. Поверхность покрылась толстой войлочной гофрированной массой. Сперва она была белой, потом стала зеленой и, наконец, почернела. Вначале бульон оставался прозрачным. Через несколько дней он приобрел очень интенсивный желтый цвет. Надо было узнать, обладает ли и эта жидкость бактерицидными свойствами плесени.
Разработанный еще в 1922 году метод исследования лизоцима великолепно подходил для данного случая. На чашке с агаром Флеминг вырезал желобок и заполнил его желтой жидкостью, затем засеял различные микробы (под прямым углом к желобку) полосками, доходившими до краев чашки. Жидкость оказалась такой же активной, как и плесень. Разрушались те же микробы. Значит, жидкость содержала то же бактерицидное (или бактериостатичное) вещество, которое выделяла плесень. Какова же была его сила? Флеминг испробовал действие растворов, разведенных в двадцать, сорок, двести и пятьсот раз. Последний раствор все еще подавлял рост стафилококков. Таинственное вещество, находившееся в золотистой жидкости, обладало, казалось, необычайной активностью. У Флеминга тогда не было возможности установить, что полезного вещества в бульоне приходилось не более одного грамма на тонну. Даже морская вода содержит больше золота.
Теперь следовало определить вид плесени. Есть тысячи ее разновидностей. Познания Флеминга в микологии (наука о грибах) были весьма поверхностны. Он взялся за книги и выяснил, что это был «пенициллиум хризогенум» (penicillium chrysogenum).
…
Еще Листер замечал влияние плесени на бактерии, нь неправильно интерпретировал:В своих рабочих тетрадях (Commonplace Books, находящиеся в Королевском хирургическом колледже) Листер 25 ноября 1871 года описал следующее явление: в стакане с мочой, оставленном открытым, оказалось множество бактерий, а также зернистые нити, в которых он узнал плесень. Заметив, что бактерии находились как будто бы в угнетенном состоянии, он провел ряд опытов, чтобы узнать, не превращается ли жидкость после разрастания в ней плесени в неблагоприятную среду для бактерий. Опыты не дали убедительных результатов, и он их прекратил. Но Листер отметил, что когда войлочная масса, которую он принимал за «пенициллиум глаукум» (penicillium glaucum), покрывала поверхность мочи, «микробы становились совершенно неподвижными и чахли»25. Он предположил, что это происходит от недостатка кислорода: пенициллиум поглощал кислород из бульона и, закрывая поверхность, прекращал доступ воздуха к микробам.…
И все-таки споры не поднялись на агаре, чтобы сказать мне: «Знаете, мы выделяем антибиотик». Флеминг
Таинственная плесень, занесенная с Пред-стрит, вырабатывала вещество, останавливавшее развитие некоторых патогенных микробов. Прежде всего надо было выяснить: обладают ли другие плесени тем же свойством? Друзья Флеминга помнят, как у него в тот период при виде предмета, покрывшегося плесенью, в глазах разгоралось любопытство, помнят, как он всех одолевал просьбами дать ему какую-нибудь старую позеленевшую обувь. Скульптор Дженнингс, член клуба Челси, вспоминает, как однажды Флеминг вдруг сказал окружавшим его художникам: «Друзья, если у кого-нибудь из вас есть заплесневелые туфли, мне бы очень хотелось, чтобы вы мне их подарили». Кто-то спросил, зачем они ему нужны. «Для одной моей лабораторной работы».
Опыты показали, что ни одна другая из исследованных Флемингом плесеней не выделяла антибактериального вещества. Значит, его «пенициллиум» все больше заслуживал внимания. Для продолжения исследований Флемингу требовалось большое количество плесневого бульона.
…
Вскоре Флеминг потребовал, чтобы Краддок немедленно прекратил исследования над меркурохромом и занялся производством плесневого бульона. Сначала они выращивали «пенициллиум» на мясном бульоне при температуре тридцать семь градусов. Но миколог Ла Туш сказал, что самая благоприятная для «пенициллиума» температура – двадцать градусов. В помещении, где работал Краддок, поставили большой черный термостат. Краддок делал посевы спор плесени в плоские бутыли, которые служили для приготовления вакцины, и на неделю ставил их в термостат. Таким образом, он ежедневно получал от двухсот до трехсот кубических сантиметров бульона с таинственным веществом. Этот бульон он пропускал через фильтр Зейца при помощи велосипедного насоса. Словом, пользовался совершенно кустарным методом.
Флеминг изучал культуры, выясняя, на какой день роста, при какой температуре и на какой питательной среде он получит наибольший эффект от действующего начала. Аппаратура, усовершенствованная им во времена работы над лизоцимом, давала возможность измерить активность и концентрацию культур. Он заметил, что если хранить бульон при температуре лаборатории, его бактерицидное свойство быстро исчезало. Значит, чудесное вещество было очень нестойким. Он обнаружил, что оно становилось более стойким, если щелочную реакцию бульона (рН9) приблизить к нейтральной (pH 6—8).
Наконец Флемингу удалось подвергнуть свой бульон испытанию, которое не мог выдержать
ни один антисептик, а именно определению токсичности. К его великой радости, которую он, впрочем, не высказал, оказалось, что этот фильтрат, обладающий огромной антибактериальной силой, для животных, видимо, очень мало токсичен. Внутривенное введение кролику двадцати пяти кубических сантиметров этого вещества оказывало не более токсическое действие, чем введение такого же количества бульона. Полкубического сантиметра бульона, введенного в брюшную полость мыши, весом в двадцать граммов, не вызвали никаких симптомов интоксикации. Постоянное орошение больших участков кожи человека не сопровождалось симптомами отравления, и ежечасное орошение конъюнктивы глаза в течение всего дня даже не вызвало раздражения. In vitro это вещество, разведенное в шестьсот раз, задерживает рост стафилококков, но не нарушает функций лейкоцитов, так же как и обычный бульон.
Все это становилось в высшей степени интересным. «Наконец-то перед ним был антисептик, о котором он мечтал, – рассказывает Краддок, – он нашел вещество, которое даже в разведенном виде оказывало бактерицидное, бактериостатическое и бактериолитическое действие, не причиняя вреда организму...» Как раз в это время Краддок страдал синуситом – воспалением придаточных пазух носа. Флеминг промыл ему носовую пазуху пенициллиновым бульоном. В его лабораторных записях помечено:
«9 января 1929 года. Антисептическое действие фильтрата на придаточные пазухи Краддока:1. Посев из носа на агар: 100 стафилококков, окруженных мириадами палочек Пфейфера. В правую придаточную пазуху введен кубический сантиметр фильтрата.
2. Посев через три часа: одна колония стафилококков и несколько колоний палочек Пфейфера. Мазки – столько же бактерий, сколько и раньше, но почти все они фагоцитированы».
Итак, даже сильно разведенное, это вещество убивало почти все стафилококки. То, что оно не оказывало действия на палочки Пфейфера, Флеминга не удивило, ведь они были из тех микробов, которые при первых же опытах проявили устойчивость. Первая скромная попытка лечения человека неочищенным пенициллином дала неплохие результаты.
…
Первое человеческое существо после Краддока, кого Флеминг лечил своим бульоном, была женщина. Она поскользнулась, выходя с вокзала Паддингтон, и попала под автобус. Ее привезли в Сент-Мэри с ужасной раной на ноге. Ей ампутировали ногу, но начался сепсис, и больную ожидала смерть. Флеминг, к которому обратились за консультацией, нашел, что она безнадежна, но тут же сказал: «У меня в лаборатории произошло одно любопытное явление: у меня есть культура стафилококков, которых поглотила плесень». Он намочил повязку в плесневом бульоне и наложил ее на ампутированную поверхность. Он не возлагал на эту попытку серьезных надежд. Концентрация была слишком слабой, а болезнь уже распространилась по всему организму. Он ничего не добился.
…
Нам всем было ясно, – рассказывает Краддок, – что пока пенициллин смешан с бульоном, он не может быть использован для инъекций, его надо было очистить от чужеродного белка». Повторное введение чужеродного белка могло вызвать анафилаксию. Прежде чем начать серьезные испытания пенициллина в клинике, необходимо было его экстрагировать и концентрировать. «Я всегда считал, – продолжает Краддок, – что нужно экстрагировать и очистить пенициллин, чтобы употреблять его для инъекций. Поручая мне работу над меркурохромом, Флеминг сказал, что если он не будет токсичен, его можно будет когда-нибудь применять для внутривенных вливаний. Я уверен, что и в отношении пенициллина у него были такие же намерения, при условии, что мы смогли бы добыть из бульона чистое и стойкое вещество».
И вот два молодых ученых, Ридли и Краддок, недавно закончившие медицинское училище, пустились в это трудное предприятие: отыскать решение химической задачи, которая оказалась невероятно сложной. Поразительно, что они, сами того не подозревая, чуть было не добились успеха. «Ридли обладал основательными знаниями в области химии и был в курсе последних достижений, – рассказывает Краддок, – но с методикой экстрагирования нам приходилось знакомиться по книгам. Мы прочитали описание обычного способа: в качестве растворителей употребляются ацетон, эфир или спирт. Выпаривать бульон надо было при довольно низкой температуре, потому что, как мы уже знали, тепло разрушало наше вещество. Значит, процесс придется вести в вакууме.
Когда мы приступили к этой работе, мы почти ничего не знали, к концу мы стали чуть более сведущими; мы занимались самообразованием».…
«Вначале мы были полны оптимизма, – говорит Краддок, но проходили недели, а у нас получалась все та же вязкая масса, которая, помимо всего, была нестойкой. Концентрат сохранял свои свойства только в течение недели. Через две недели он окончательно терял активность». Позднее, когда в результате замечательных работ Чэйна был получен чистый пенициллин, Краддок и Ридли поняли, что были очень близки к решению задачи. «Тогда же, естественно, мы не могли знать, что нам оставалось преодолеть последнее препятствие. Ведь у нас было столько разочарований! Казалось, он уже в наших руках, мы ставили его в холодильник, а через неделю он разлагался. Если бы в тот момент появился опытный химик, мне кажется, он помог бы нам преодолеть это последнее препятствие. И мы бы опубликовали сообщение о нашей работе. Но специалист так и не явился». Таким образом, попытки добыть чистый пенициллин прекратились.
…
В ожидании, когда врачи и хирурги больницы дадут ему возможность испытать свой пенициллин на больных (результаты этих опытов он напечатал в 1931—1932 годах), Флеминг закончил свою работу над стафилококками. Она появилась в «System of Bacteriology». Несколько позже он вернулся к этой теме в связи с «Бандабергской катастрофой». В Австралии в 1929 году в Бандаберге (Квинсленд) детям сделали противодифтерийную прививку, и двенадцать из них через тридцать четыре часа умерли. Вакцина оказалась загрязненной очень вирулентным стафилококком.
…
Тем временем один из лучших в Англии химиков, профессор Гарольд Райстрик, преподававший биохимию в Институте тропических заболеваний и гигиены, заинтересовался веществами, выделяемыми плесенями и, в частности, пенициллином. К нему присоединились бактериолог Ловелл и молодой химик Клеттербук. Они получили штаммы от самого Флеминга и из Листеровского института. Группа Райстрика вырастила «пенициллиум» не на бульоне, а на синтетической среде. Клеттербук, ассистент Райстрика, исследовал фильтрат с биохимической точки зрения, Ловелл – с бактериологической.
Райстрик выделил желтый пигмент, который окрашивал жидкость, и доказал, что этот пигмент
не содержит антибактериального вещества. Целью, естественно, было выделить само вещество. Райстрик добился получения пенициллина, растворенного в эфире, он надеялся, что, выпарив эфир, получит чистый пенициллин, но во время этой операции нестойкий пенициллин, как всегда, исчезал. Активность же самого фильтра с каждой неделей становилась все меньшей, и в конце концов он полностью потерял свою силу.
…. ….
В Рокфеллеровском институте доктор Дюбо вел научно-исследовательскую работу, направленную на получение антибиотика против гноеродных микробов. Он
придумал очень остроумный способ: заразил участок земли этими микробами, считая, что в процессе борьбы за существование в земле путем отбора разовьются какие-то микроорганизмы.
Из этой зараженной земли он выделил культуру и в самом деле обнаружил в ней бактерию bacillus brevis 3/4, которая обладала мощным бактерицидным действием на многие патогенные микробы. Он сумел выделить нужное вещество и назвал его «тиротрицином», который, как потом Дюбо убедился, состоит из двух антибиотиков: грамицидина и тироцидина. К сожалению, и тот и другой токсичны для почек, но могут с успехом применяться наружно для местного лечения.
Так факел науки переходил с континента на континент. Ученые шли по правильному пути.
К 1939 году Флеминг, профессор бактериологии, помощник директора Института, занимал в своей отрасли науки весьма видное место. Но ему уже исполнилось пятьдесят шесть лет, и было мало вероятия, что он успеет до того, как уйдет в отставку, сделать еще какое-нибудь необычайное открытие. Правда, была надежда на пенициллин, но, продолжая о нем говорить, сам он, казалось, уже отчаялся увидеть его когда-нибудь в чистом виде.
…
В августе 1939 года Флеминг с женой поехали в Нью-Йорк на III Международный конгресс микробиологов. Там Флеминг познакомился с доктором Дюбо, чьими работами он восхищался. Дюбо спросил Флеминга о дальнейшей судьбе пенициллина, этого вещества, которое, казалось, было столь многообещающим.
Флеминг рассказал, что он передал пенициллин крупнейшему лондонскому химику с просьбой выделить его в чистом виде, но тот ответил, что вещество слишком нестойкое и с химической точки зрения «не заслуживает, кажется, никакого внимания».В Америке доктор Роджер Рид, работавший в Сельскохозяйственном колледже Пенсильвании, прочтя сообщения Флеминга, решил сделать их темой своей диссертации. Он попросил у руководства колледжем сто долларов на свои опыты: он хотел испытать на зараженных пневмококками мышах плесневый бульон, а также ввести пенициллин коровам, больным маститом. Ему отказали в этой ничтожной субсидии, а профессору, который предложил финансировать опыты, угрожали увольнением! На этом же конгрессе Флеминг встретился еще с одним американским медиком Элвином Ф. Кобёрном, который очень интересовался лизоцимом и микробами зева, проявляющими стойкость к слюне.
Флеминг был счастлив, когда узнал, что его работы, проведенные с такой тщательностью в крошечной лаборатории Сент-Мэри, стали известны за океаном и заинтересовали американских ученых.
…. …..
Чэйн явился к Флори, который сообщил ему, что на своей кафедре придает очень большое значение биохимии, так как в основе всякого патологического изменения лежат биохимические явления. Флори обещал Чэйну полную свободу действий и выбора темы своих исследовательских работ и подал ему мысль заняться изучением одного вещества, растворяющего бактерии, – лизоцима, который, как сказал Флори, играет роль в защите организма против бактерий и, возможно, способствует заживлению язвы желудка.
В 1936 году Чэйн с Эпштейном, получившим Родсовскую стипендию, приступили к этой работе; в то же время они изучали биохимическое действие змеиного яда. Прежде всего надо было проверить, является ли в самом деле лизоцим ферментом, как утверждал Флеминг, то есть веществом, чье присутствие усиливает некоторые реакции и расщепляет некоторые молекулы. Если это так, то в бактериальной клетке есть такой
субстрат, на который действует лизоцим, так как ферменты и субстраты настолько же прилажены друг к другу, как ключ к замку, что и объясняет специфические особенности ферментов. Опыты дали положительный ответ. Чэйну удалось выделить из желтого кокка micrococcus lysodeicticus вещество (полисахарид), которое распадалось под действием лизоцима и в данном частном случае являлось как бы замком.
Удачно осуществив свою работу, ученые, естественно, решили тщательно изучить всю литературу по этому вопросу, просмотреть все старые публикации и выяснить, что уже сделано в этой области. Чэйн обнаружил около двухсот сообщений о разных антибактериальных веществах. Одни из этих веществ, наподобие лизоцима, оказывали лизирующее действие на микробы, растворяли их, другие же разными способами убивали тот или иной микроб. Перед Чэйном открылось огромное поле для исследовательской деятельности: микробный антагонизм. Флори и Чэйн обсудили эту тему.
Из всего прочитанного Чэйн нашел самым интересным сообщение Флеминга о пенициллине, которое тот сделал в 1929 году. Из этого труда Чэйн узнал, что существует вещество, «наделенное многообещающими антибактериальными свойствами». Это вещество имело перед лизоцимом то преимущество, что оно уничтожало болезнетворные микробы и к тому же, по утверждению Флеминга, не оказывало токсического действия на организм. Продолжая изучать литературу, Чэйн убедился, что были приложены серьезные усилия, чтобы выделить и очистить пенициллин, чего нельзя было сказать о других веществах. Но все усилия оказались тщетными.
Чэйн готов был взяться за эту работу, но она требовала довольно больших денег, а их не было. Как-то, пересекая с Флори прекрасный университетский парк, Чэйн спросил своего руководителя, нельзя ли получить из Рокфеллеровского фонда несколько тысяч долларов. Английский Медицинский научно-исследовательский совет предоставлял небольшие субсидии в пятьдесят-сто фунтов, но это ничего бы не дало ученым. Флори сделал запрос и через некоторое время сообщил Чэйну, что, если представить интересный план биохимической исследовательской работы, вероятно, можно будет добиться дотации. Чэйн ответил, что кет ничего легче, и сразу написал для Рокфеллеровского фонда меморандум, в котором он предлагал три темы: змеиные яды, факторы диффузии29 и бактериальный антагонизм. План был рассчитан на десять лет.
Флори одобрил меморандум и через несколько месяцев радостно сообщил Чэйну, что фонд утвердил субсидию в пять тысяч долларов. Это была чудесная новость. Теперь работе лаборатории биохимии не угрожала остановка из-за отсутствия смехотворно маленьких сумм, необходимых для покупки требующейся аппаратуры. Чэйн приступил к исследованию пенициллина в начале 1939 года; летом он уехал в отпуск в Бельгию. Когда он вернулся, уже была объявлена война.
Почему он начал с пенициллина? Флори с Чэйном решили, что будут изучаться три вещества: один из ферментов – пиоцианазу; антибактериальные вещества, выделяемые актиномицетами (позже исследование этих веществ увенчалось открытием мощных антибиотиков, в том числе стрептомицина), и пенициллин. У пенициллина по сравнению с остальными веществами было много преимуществ. Его уже изучали во многих аспектах, выяснили, что он нетоксичен, и, хотя он был нестоек и не поддавался очистке, его по крайней мере было легко добывать.
…